Lo Spedale non si occupava solo della cura dei malati, ma anche dell’assistenza e del ricovero dei pellegrini che sostavano in città e dei bambini abbandonati.

Le cure erano gratuite, solo in caso di morte l’ospedale tratteneva i beni che aveva con sé il malato. Il regolamento leopoldino del 1764 segnò l’evoluzione verso finalità più strettamente sanitarie, eliminando l’assistenza agli indigenti, ai pellegrini e ai malati cronici o incurabili (malattie come la tisi erano considerate incurabili), rivolgendo gli sforzi ai soli malati che potevano sperare di guarire con le cure somministrate.

Per adempiere a questi compiti lo spedale disponeva di appositi locali: infermerie separate per donne e uomini, ciascuna dei quali con la sua cappella, il granaio, il refettorio ecc., in comune avevano altri spazi funzionali come la lavanderia, il forno, le dispense, le cantine, i magazzini, la cucina. 

Lavoravano nello spedale numerose figure, a partire dallo Spedalingo ovvero il rettore, che era il responsabile della gestione della struttura e del patrimonio. La famiglia dell’ospedale era poi composta dai salariati, come gli infermieri, e i commessi, persone che hanno chiesto di vivere in ospedale e che svolgevano lavori specifici o variabili in cambio di vitto e alloggio.

Prestavano la loro opera negli spedali anche i medici, eletti dalle magistrature fiorentine che controllavano l’ospedale e regolarmente stipendiati in denaro o in natura già dal XIV secolo: alla Misericordia ne troviamo prima uno, poi due in seguito ai primi ingrandimenti della struttura e quattro a partire dal '600.